Uji Peroksida Lipid Dalam Cairan Biologis

1. Tujuan :
   

Menetapkan kadar peroksida lipid dalam cairan biologis

1. Teori Singkat :
   

Asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi peroksida lipid. PUFA (Poly Unsaturated Fatty Acids) pada manusia disintesis dari MUFA (Mono Unsaturated Fatty Acid ), melalui penambahan ikatan rangkap antara ikatan rangkap yang sudah ada (D⁹) dan gugus karboksil – menghasilkan asam lemak w-9.

Peroksidasi lipid adalah reaksi penyerangan radikal bebas terhadap asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) yang mengandung sedikitnya tiga ikatan rangkap. Reaksi ini dapat terjadi secara alami di dalam tubuh yang diakibatkan oleh pembentukan radikal bebas secara endogen dari proses metabolisme di dalam tubuh. Peroksidasi lipid diinisiasi oleh radikal bebas seperti radikal anion superoksida, radikal hidroksil dan radikal peroksil. Radikal bebas secara berkesinambungan dapat dibuat oleh tubuh kita. Setiap radikal bebas yang terbentuk oleh tubuh dapat memulai suatu reaksi berantai yang akan terus berlanjut sampai radikal bebas ini dihilangkan oleh radikal bebas lain dan oleh sistem antioksidan tubuh (Halliwell & Gutteridge 1999).

Peroksida lipid selanjutnya mengalami dekomposisi menjadi malondialdehid (MDA). MDA produk akhir proses peroksidasi lipid dan yang paling sering digunakan untuk mengukur proses peroksidasi lipid. Pengujian MDA dilakukan dengan TBA (Asam tiobarbiturat) yaitu akan membentuk senyawa warna merah muda dan diukur serapan pada panjang gelombang 532 nm, juga dapat diukur dengan HPLC ( High Performance Liqiud Chromatography )

Proses peroksidasi lipid

Akibat serangan ROS terhadap asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) pada membran 3 tahap:

1Bahan

1. Hemolisat darah
   
2. Larutan asam tikoloroasetat (TCA) 10%
   
3. Larutan TBA
   

 

1. Hasil Pengamatan
   
   1. Uji 1
      

    Absorbansi     = 0,107

    Kadar MDA    = A/

            = 0,107/153.000 M^-1 cm ^-1

            ⁼ 7 x 10^-4

1. Uji 1
   

Absorbansi     = 0,090

Kadar MDA    = A/

= 0.09/153.000 M-1 cm -1

= 6x 10-4

1. Uji 1
   

Absorbansi     = 0,031

Kadar MDA    = A/

= 0.031/153.000 M-1 cm -1

=2 x 10-4

1. Pembahasan
   

Pada praktikum uji peroksida lipid dalam cairan biologis. Kita mengukur kadar peroksida lipid di dalam cairan biologis, cairan biologis yang digunakan adalah darah. Asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi peroksida lipid. PUFA (Poly Unsaturated Fatty Acids) pada manusia disintesis dari MUFA (Mono Unsaturated Fatty Acid ), melalui penambahan ikatan rangkap antara ikatan rangkap yang sudah ada (D⁹) dan gugus karboksil – menghasilkan asam lemak w-9. .

Peroksidasi lipid adalah reaksi penyerangan radikal bebas terhadap asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) yang mengandung sedikitnya tiga ikatan rangkap. Reaksi ini dapat terjadi secara alami di dalam tubuh yang diakibatkan oleh pembentukan radikal bebas secara endogen dari proses metabolisme di dalam tubuh. Peroksidasi lipid diinisiasi oleh radikal bebas seperti radikal anion superoksida, radikal hidroksil dan radikal peroksil. Radikal bebas secara berkesinambungan dapat dibuat oleh tubuh kita. Setiap radikal bebas yang terbentuk oleh tubuh dapat memulai suatu reaksi berantai yang akan terus berlanjut sampai radikal bebas ini dihilangkan oleh radikal bebas lain dan oleh sistem antioksidan tubuh (Halliwell & Gutteridge 1999).

Peroksidasi lipid merupakan proses yang bersifat kompleks akibat reaksi asam lemak tak jenuh jamak penyusun fosfolipid membran sel dengan senyawa oksigen reaktif (ROS), membentuk hidroperoksida. Pertama, ROS ialah senyawa turunan oksigen yang lebih reaktif dibandingkan oksigen pada kondisi dasar (ground state).Kedua, ROS tidak hanya terdiri atas molekul oksigen tanpa pasangan elektron seperti radikal hidroksil (·OH), radikal superoksida (·O2-), dan nitrit oksida (NO·), tetapi juga molekul reaktif yang memiliki electron berpasangan. Molekul oksigen yang memiliki electron berpasangan tersebut diantaranya, hidrogen peroksida (H2O2), asam hipoklorous (HOCl), dan anion peroksinitrit (ONOO-).3

Target utama peroksidasi oleh ROS adalah asam lemak tak jenuh majemuk (PUFA) dalam lipid membran. PUFA didegradasi oleh radikal-radikal bebas membentuk malondialdehid (MDA). Kadar MDA dalam serum berfungsi sebagai sebuah penanda kerusakan seluler akibat radikal bebas.

Peroksidasi lipid dapat menghasilkan oksigen tunggal, hidroperoksida dan epoksida lipid. Aldaheida yang dapat terbentuk pada peroksidasi lipid adalah malondialdehida (MDA) dan 4-hidroksinonenal (4-HNE). MDA adalah metabolit utama pada asam lemak arakidonat (20:4). Uji MDA (TBARS) digunakan untuk mengukur peroksidasi yang terjadi pada membran lipid. 4-HNE dihasilkan oleh arakidonat melalui autooksidasi. 4-HNE bereaksi dengan komponen seluler lebih kuat dibandingkan dengan MDA. Oleh karena itu 4-HNE lebih toksik dibandingkan MDA akan tetapi tidak reaktif dengan TBA (Best, 2007). Gambar 13 Peroksidasi lipid pada asam lemak tak jenuh rantai panjang (Murray)

Hal pertama yang harus dilakukan adalah mengambil darah dari probandus dalam hal ini darah yang di ambil pada bagian lengan dengan volume pengambilan 2 ml untuk dua uji dan satu blanko.

Criteria probandus yaitu harus sehat dan memiliki postur badan agak gemuk agar dari darah yang di ambil mengandung lipid yang diinginkan..

Pada uji 1 dan 2 masing – masing ditambah kan 1ml darah sedangkan blanko ditambahkan aquadest selanjutnya pada uji 1,2 dan blanko ditambahkan TCA 10% penambahan TCA bertujuan agar protein yang terkandung dalam darah pada uji 1 dan 2 mengalami presipitasi setelah di sentrifugasi pada 4000rpm. Presipitasi protein dilakukan karena kandungan protein yang terkandung dalam darah akan mengganggu penetapan kadar peroksida lipid.

Mekanisme TCA 10 % sebagai agen presipitasi yakni ion negatif dari TCA akan bergabung dengan protein yang sedang berada pada kondisi sebagai kation (pH larutan dalam kondisi asam hingga pH isoelektrik protein) hingga membentuk garam protein. Beberapa garam yang dihasilkan tersebut tidak larut dengan demikian metode ini dapat digunakan untuk memisahkan protein dari larutan. . Umumnya agen presipitasi akan melarut sedangkan garam protein akan terdekomposisi dengan adanya penambahan basa (membentuk protein yang bermuatan negatif atau anionic protein). TCA umumnya digunakan untuk protein-protein yang telah berada dalam keadaan bebas pada filtrat darah dan pada pemeriksaan awal materi biologis.

Selanjutnya setelah disentrifugasi pada 4000rpm dan supernatantnya diambil dan tambahkan larutan TBA 0,67% yang telah dipanaskan. Tujuan pemanasan adalah agar TBA segera bereaksi dengan supernatant dan memberikan warna merah yang menandakan bahwa mengandung malondialdehida (MDA). Selanjutnya didihkan selama 10 menit, dan setelah dingin dibaca pada panjang gelombang 532 nm

Malonaldehida, 4-hidroksinonenal, dan heptanal,merupakan aldehida-aldehida hasil dekomposisi senyawa hidroperoksida, yang bereaksi dengan TBA dan menghasilkan warna merah. Warna merah tersebut menyerap cahaya ultraviolet pada panjang gelombang (λ) 532 nm (Inoue dkk., 1998). Kemampuan TBA bereaksi dengan aldehida atau keton, karena adanya atom karbon nomor 5 (C-5) TBA yang reaktif (Guzman-Chozas dkk., 1998).Rasio reaksi antara TBA dengan aldehida berbedabeda,misalnya rasio reaksi TBA dengan 2-heksenal adalah 1:1 dan rasio reaksi TBA dengan malonaldehida adalah 2:1 (Gambar 1) (Guzman-Chozas dkk., 1998).

Ada tidaknya ikatan rangkap pada asam lemak dapat mempengaruhi hasil akhir oksidasi lemak. Kishida dkk. (1993b) menyatakan, bahwa oksidasi asam lemak tak-jenuh menghasilkan thiobarbituric acid reactive substances, sedangkan oksidasi asam lemak jenuh tidak menghasilkan thiobarbituric acid reactive substances.

Uji TBA hanya mendeteksi MDA bebas dan mengukur jumlah MDA bebas dalam sistem lipid peroksidasi. Pada uji 1 dan 2 menunjukkan warna merah muda yang bearti positif terkandung Malondialdehida. Malondialdehida merupakan proses akhir dari peoksidasi lipid. Sedangkan blanko tidak menunjukkan perubahan warna dan larutan blanko tetap bening. Pada pembacaan panjang gelombang 532 nm oleh UV VIS diperoleh kadar Malondialdehida (MDA) sebagai berikut

• Uji 1     = 7 x 10^-4
  
• Uji 2    = 6 x 10^-4
  
• Blanko    = 2 x 10^-4
  

1. Kesimpulan
   
   1. Kadar MDA yang terkandung di dalam darah adalah Uji 1     = 7 x 10-4 dan Uji 2    = 6 x 10-4
      
   2. Penambahan TBA 0,67 % memberikan warna merah muda pada uji 1 dan 2
      
   3. Penambahan TBA 0,67 % tidak memberikan reaksi apapun pada blanko
      
   4. Kemampuan TBA bereaksi dengan aldehida atau keton, karena adanya atom karbon nomor 5 (C-5) TBA yang reaktif.
      
   5. Penambahan TCA bertujuan untuk mengendapkan protein yang terdapat pada darah sehingga tidak mengganggu penetapan kadar peroksida lipid
      
      
      
2. Daftar Pustaka
   
   1. Suhartono Bambang Setiawan, Peroksidasi Lipid dan Penyakit Terkait Stres Oksidatif pada Bayi Prematur Eko